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ノックイン

ノックイン（KI）は、ゲノム上の標的部位へ目的のDNA配列を導入する代表的なゲノム編集手法です。疾患モデルやレポーター細胞、タグ融合細胞の作製など、幅広い研究に利用されています。本記事では、ノックインの仕組みや主な用途、作製手法に加え、外部委託時の注意点について解説します。

刑部祐里子Yuriko Osakabe

東京科学大学生命理工学院教授
生命理工学系生命理工学コース
所属学会：日本分子生物学会、日本農芸化学会、日本ゲノム編集学会、日本植物生理学会、日本植物学会、日本植物バイオテクノロジー学会

研究室サイトhttps://search.star.titech.ac.jp/titech-ss/pursuer.act?event=outside&key_rid=B000256365&lang=jp

様々な生物におけるゲノム編集技術の応用を目指した基礎研究をテーマに、特に、新規ゲノム編集技術の基盤開発研究を行っています。ゲノム編集技術の医療応用や植物分野の応用技術開発を進めています。

ノックインとは？

ノックイン（KI）とは、ゲノム上の特定の部位へ、1塩基置換から短いDNA配列（loxP配列やタグ配列など）、蛍光遺伝子やレポーター遺伝子などの長鎖DNA配列まで、目的の配列を導入するゲノム編集手法です。

CRISPR/Cas9などで標的部位を切断した後、細胞の相同組換え修復（HDR：Homology-Directed Repair）機構を利用し、あらかじめ用意したドナーDNA（ssODNやドナーベクター）を標的部位へ導入します。

ノックアウトが主に挿入・欠失（indel）による遺伝子機能の不活化を目的とするのに対し、ノックインは目的のDNA配列を正確な位置へ導入することを目的とする点が大きな違いです。ドナーDNAの設計やHDR効率の最適化、導入後の検証が必要となることから、一般的にノックアウトよりも作製難易度が高いとされています。

ノックインの
主な目的・用途

疾患モデルの作製：ヒトの疾患に関連する1塩基置換変異や病的バリアントを細胞・動物へ導入し、病態を再現する。
レポーター細胞の作製：蛍光タンパク質などを標的遺伝子へ融合し、遺伝子発現や細胞分化、タンパク質の局在を可視化する。
タグ融合タンパク質の作製：Hisタグなどを付加し、タンパク質の精製や検出を容易にする。
ヒト化モデルの作製：動物の遺伝子をヒト型配列へ置き換え、ヒトに近い薬物代謝や免疫応答を再現する。

ノックインでは、ドナーDNAの設計やHDR効率の最適化に加え、目的の配列が標的部位へ正確に導入されていることを確認する解析が重要です。これらの設計・検証が、編集効率やノックインの成否を大きく左右します。

ノックインの
主な作製手法

CRISPR/Cas9＋ssODN／ドナーベクター：Cas9によるDNA切断と相同組換え修復（HDR）を利用し、短いDNA配列から長鎖DNA配列まで導入する手法です。導入配列が長くなるほど、HDR効率の最適化やドナーDNAの設計が重要になります。
プール細胞を用いたノックイン効率の評価：編集直後のプール細胞を解析し、目的の配列が標的部位へ導入されているかを早期に評価する手法です。シングルクローン化前に編集効率を把握できるため、後工程の効率化につながります。

ノックインでは、目的の配列が標的部位へ正確に導入されていることに加え、非特異的な挿入や意図しないゲノム改変が生じていないことを確認する解析工程が重要です。

ゲノム編集受託サービス会社のノックイン事例

ノックインの活用イメージをより具体的に掴めるよう、ゲノム編集受託サービス会社が公開している事例を紹介します。

GenAhead Bio

引用元：GenAhead Bio公式HP（https://jp.genaheadbio.co.jp/genome-editing/）

GenAhead Bioの公式サイトでは、骨髄性プロトポルフィリン症（EPP）のモデルiPS細胞の作製事例が公開されています。これは、FECH遺伝子のc.286C>Tという1塩基置換を導入し、疾患原因となる変異を持つiPS細胞を再現したもの。患者サンプルの入手が難しい希少疾患でも、点変異ノックインで疾患モデルを作製できる例として紹介されています。

参照元：GenAhead Bio公式HP（https://jp.genaheadbio.co.jp/genome-editing/）

タカラバイオ

引用元：タカラバイオ公式HP（https://www.takara-bio.co.jp/research/ips/ips-11.htm）

タカラバイオの公式サイトでは、ヒトiPS細胞株253G1にsgRNAとCas9発現プラスミド、ssODNを導入し、鎌状赤血球貧血症の原因変異（ヘモグロビンβ鎖6番目のアミノ酸置換）を再現した事例が紹介されています。101クローンをシーケンス解析した結果、目的の変異を持つクローンを1つ獲得できたとされ、点変異ノックインの難易度の高さがうかがえます。

参照元：タカラバイオ公式HP（https://www.takara-bio.co.jp/research/ips/ips-11.htm）

セツロテック

引用元：セツロテック公式HP（https://www.setsurotech.com/genome-editing/cell/knockin-cell/）

セツロテックでは、独自技術「VIKING法」を用いて、ゲノム上の指定位置（セーフハーバーサイトなど）に任意の配列を挿入したノックイン培養細胞を作製するサービスを提供しています。挿入配列にプロモーター配列を含めることで、外来遺伝子の発現を狙ったノックインも可能とされています。

参照元：セツロテック公式HP（https://www.setsurotech.com/genome-editing/cell/knockin-cell/）

外部委託する際の注意点

挿入配列の長さへの対応力：1塩基置換や短いDNA配列から、レポーター遺伝子などの長鎖DNA配列まで対応できるか。
標的部位への導入確認と非標的部位への挿入評価：目的の配列が標的部位へ正確に導入されていることに加え、ランダムインテグレーションなどの非特異的な挿入をどのように評価しているか。
ホモ接合体／ヘテロ接合体の作製：疾患モデルや研究目的に応じて、両アレル（ホモ接合）または片アレル（ヘテロ接合）への導入に対応できるか。
納期とフィードバック体制：導入配列の長さや編集難易度によって納期が変動しやすいため、進捗共有やフィードバック体制が整っているか。

ノックインでは、ドナーDNAの設計やHDR効率の最適化がノックイン効率を左右します。受託会社を選定する際は、事前に類似案件の実績を確認しておくと、研究計画とのミスマッチを防ぎやすくなります。

まとめ

ノックインは、疾患モデルの作製からレポーター細胞・タグ融合タンパク質の作製、ヒト化モデルの開発まで幅広く利用されている代表的なゲノム編集手法です。挿入配列の設計や確認方法によって難易度・成功率が大きく変わるため、外部委託を検討する際は、各社の技術的な裏付けと実績を比較したうえで選定することが重要です。

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監修者からのコメント

刑部祐里子Yuriko Osakabe

東京科学大学生命理工学院教授
生命理工学系生命理工学コース
所属学会：日本分子生物学会、日本農芸化学会、日本ゲノム編集学会、日本植物生理学会、日本植物学会、日本植物バイオテクノロジー学会

研究室サイトhttps://search.star.titech.ac.jp/titech-ss/pursuer.act?event=outside&key_rid=B000256365&lang=jp

ノックインはノックアウトに比べて設計・確認の難易度が高い技術です。挿入配列の長さやホモ／ヘテロの作り分けなど、目的に応じた設計力が成功のカギを握ります。外部委託の際は、オンターゲット・オフターゲットの検証体制まで含めて、実績のある受託会社を選んでいただきたいと思います。

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